◇◇新语丝(www.xys.org)(xys7.dxiong.com)(xys.ebookdiy.com)(xys2.dropin.org)◇◇ 　　基因序列是怎么巧妙测出来的 　　·方舟子· 　　11月19日，英国著名生物化学家弗雷德里克·桑格在睡梦中去世，享年95岁。 在学生物出身的人当中，桑格是一个尽人皆知的传奇式人物，传奇到很多人听到 他的死讯时，都很惊讶他还活着。他一个人解决了现代生物学的两大实际难题： 怎么测定蛋白质的序列和怎么测定DNA（脱氧核糖核酸）的序列。因此他两次获 得诺贝尔奖，在历史上，只有四个科学家有此殊荣（其中一个——美国化学家鲍 林——第二次获得的还是没有含金量的和平奖），而桑格是最后一个。1955年， 桑格测定了第一种蛋白质（牛胰岛素）的序列和结构，3年后因此获得诺贝尔化 学奖。1977年，桑格发明了一种快速测定DNA序列的巧妙方法，3年后再次获得诺 贝尔化学奖。桑格发明的DNA测序方法很快成为各个分子生物学实验室的常规方 法，成为最常用的测序方法达20多年之久（人类基因组序列就是用这种方法测定 的），一直到现在，在小规模的DNA测序中还在使用。 　　现在的生物系研究生已经不需要自己去测DNA序列了，只需把DNA样品交给负 责测序的技术人员，自动测序仪很快就会报出结果。我这一代的研究生，则要自 己动手测序，掌握手工测序技术是基本功，跑出一个漂亮的“测序胶”，是一项 技术活。测序也是分子生物学实验中最有意思的部分，所以现在的学生不再自己 测序，真是失去了不少乐趣。实验第二天，取出测序胶辐射感光的底片，对着灯 光依次读出底片上一条条黑带，一一记录下来：A、T、G、C……就仿佛又亲手破 译了一小段生命的奥秘。 　　生命的奥秘，或者说遗传的信息，就隐藏在DNA的序列中。DNA是一种很长很 大的分子，它是由四种脱氧核苷酸链接而成的，这四种脱氧核苷酸分别简称A、T、 G、C。这四种脱氧核苷酸的排列组合，就构成了DNA序列，所谓测序，就是要知 道某一段DNA上的核苷酸是怎么排列的。在正常状态下，DNA是由两条链组成的， 这两条链的序列存在着互补：如果一条链上某个位置上是A，另一条链上的同一 位置就是T，如果是G，对应的就是C。所以只要测定了一条链的序列，根据A对应 T，G对应C的互补原则，就可以知道另一条链的序列。在细胞准备分裂、需要复 制遗传信息时，DNA的两条链解开变成两条单链，然后分别以这两条单链为模板， 根据互补的原则，合成出另一条链。这个复制过程，需要三样的东西，一样是四 种脱氧核苷酸作为原料，一样是能把脱氧核苷酸链接起来的DNA聚合酶，但这种 酶不能从头开始复制，需要前面已经有了一小段和模板结合的DNA作为复制的起 点（叫做引物），然后才能往上加新的脱氧核苷酸，所以最后一样需要的东西是 引物（在细胞中，引物是由不需要引物的另一种酶合成的）。 　　桑格就是巧妙地利用了DNA复制机理来测定序列的。桑格的巧妙之处在于， 除了上述三样东西，他给增添了一样东西：四种双脱氧核苷酸，它们在脱氧核苷 酸A、T、G、C的基础上又少了一个氧原子（分别标记为ddA、ddT、ddG、ddC）， 它们能够根据互补的原则加到DNA链上，但是由于少了一个氧原子，没法再加核 苷酸了，所以复制就到此为止。 　　好了，现在可以开始测序了。把要测序的DNA样品分成四份，每一份都加上A、 T、G、C、DNA聚合酶和引物（实验用的引物是用化学方法合成的一小段DNA作为 复制的起点，要合成它需要知道它有什么样的序列。你可能会奇怪，还没测序呢， 怎么知道引物的序列？这是因为要测序的DNA是用分子克隆技术插进载体DNA中的， 载体DNA的序列是已知的，可以根据载体DNA序列设计引物，最后测序的结果实际 上是前面有一段载体DNA序列，后面才是我们要的DNA序列）。再给每一份样品分 别加上一种双脱氧核苷酸，例如第一份加ddA，第二份加ddT，第三份加ddG，第 四份加ddC。然后在一定条件下让它们开始复制DNA。我们假定DNA模板的第一个 核苷酸是T，复制时与它互补的应该是A，在第一份样品中有ddA，如果跟T互补的 是ddA，那么这条链的复制就终止，得到的是最小的一个片段；如果结合上去的 是A，复制就继续下去，直到又碰到一个T，再次出现是ddA还是A的选择……依次 类推，在第一份样品中，复制的结果得到的是一条条以ddA为终端的不同长度的 DNA链，第二份以ddT为终端，第三份以ddG为终端，第四份以ddC为终端。把四份 样品中的新DNA链综合起来看，就是一条条长短不一的DNA片段，每个不同片段的 长度只差一个核苷酸，那么，如果能把这些DNA片段从短到长依次排列，看它们 最后一个核苷酸是什么样的，依次记下来，不就是我们想要的DNA序列了吗？ 　　这时候就需要跑“测序胶”了。把四份样品并排分别加到凝胶中，通上电。 DNA分子带负电，在电场的作用下，在凝胶中DNA片段向正极方向跑，短的DNA片 段跑得快，长的DNA片段跑得慢，这样，不同长度的DNA片段就可以在凝胶中一一 分开，处于不同的位置上。然后把凝胶烘干，覆盖上底片。为了能看出DNA片段 所在的位置，实验用的核苷酸是用放射性同位素做了标记的，它们能够发出射线 让底片感光。第二天，取出底片冲洗，可以看到上面有一条条小小的黑带表示不 同DNA片段所在的位置。从跑得最快的那条黑带开始找起，如果它是来自第一份 样品的，写下A。再找第二快的黑带，如果是来自第三份样品的，写下G。再找第 三快的黑带，看它是来自哪份样品的……这样找下去，一一记下来，比如： AGTTACC……这就是我们想知道的DNA序列。 　　在桑格同时和之后，还有别人发明别的DNA测序方法，有的已取代桑格方法 用于大规模测序。但是没有哪一种测序方法像桑格方法那样让人有耳目一新、恍 然大悟的惊艳之感。1991年我初到美国留学时，全校外国研究生集中培训，为带 本科生的课做准备。培训快结束时，要求每个人上台科普一项本学科知识。我当 时正忙于测序（还因为测序的工作，在一篇发表在英国《自然》的论文上挂名）， 就上台讲了桑格测序法。其他系的研究生居然也听得津津有味，有人还感叹道： “能想到这个方法的人，真是个天才！”然而，在他留下的唯一篇自传（写于 1988年）中，桑格却说：“和我多数的科学同行不同，我在学术方面并不聪颖。 我从未获得过奖学金，如果我的父母不是相当富裕的话，我很可能上不了剑桥大 学；不过，在那些实验非常重要以及相当狭窄的专门知识很有用处的研究领域， 我努力让自己与学术上最优秀的人并驾齐驱。”1983年，桑格65岁时他决定退休， 回家当园丁，因为他觉得发明DNA测序法是他所能达到的顶峰，再继续从事科研 已没有意义。 2013.11.27 （《新华每日电讯》2013.11.29） (XYS20131130) ◇◇新语丝(www.xys.org)(xys7.dxiong.com)(xys.ebookdiy.com)(xys2.dropin.org)◇◇