◇◇新语丝(www.xys.org)(xys.dxiong.com)(xys.3322.org)(xys.xlogit.com)◇◇ 我对司先生魏先生Nat Med的通讯文章的看法(一) 天行健 著名的司先生魏先生Nat Med的通讯文章清样已经出来几天了，一直忙，只能用些晚上 的时间仔细拜读、分析。自己经过几天的思考，还是觉得这篇通讯中有许多值得商榷的 地方，本文发表的我对于两位先生的提问和回答的看法，虽然未必全对，但愿提出来与 二位先生探讨。另外我在此申明保留本文中学术观点的版权。 在这篇NM通讯中，司先生提出魏先生原文中仍然有一些结果值得进一步探讨，然后，司 先生提出了第一个问题：“Wei et al. immunized mice with human endothelial lysates and analyzed the sera of the immunized mice using western blots. They found two major bands located at 220kDa and 30 kDa [AU: Do you mean 130kD? Wei et alindicate it is 130 kDa, not 30 kDa]（注：司先生在这问的没 错，魏等的WB中确实是220kDa和30 kDa的带最强，但后面提integrin不应该在同一句 中）, which they considered to be VEGFR-2 and αv integrin (in fact, αv integrin should be 150kDa), respectively, as well as several weak bands (see figure on p. 1164 of their paper).”（引自司魏通讯原文），司先生认为魏等采用 人内皮细胞裂解物免疫小鼠，其免疫血清除了一些弱带外，仅与220KDa和30KDa的主带 反应，并进一步提出，当采用完整细胞进行免疫时，抛开细胞类型和来源种属的差异， 被免疫的动物也应该对大量细胞膜蛋白和胞浆蛋白产生抗体反应，这些蛋白包括主要组 织相容性复合物、受体、骨架蛋白、信号传导分子等，这些蛋白都具有免疫原性，即使 不能产生针对所有这些蛋白的抗体，也应该是大部分蛋白的抗体，然而，魏等的免疫血 清为何只与少量的蛋白反应？（我翻译的司魏通讯原文相应部分）其实，司先生本身的 认识并没有错误，采用完整细胞的裂解物免疫小鼠，确实应该得到与多条带反应的免疫 血清，并且小鼠的免疫血清效价越高，被染色的条带也越多，这是已经经过大量的实验 证实的现象，毋庸怀疑，虽然不一定是如司先生所述产生的抗体可以针对大部分细胞蛋 白，但至少是针对多种细胞蛋白。但是，值得指出的是，司先生的论据和逻辑虽然都没 有错，但立论依据却错了，这可能与司先生没有仔细地阅读魏原文的材料方法部分有 关。司先生指出的是：“Wei et al. immunized mice with human endothelial lysates”，魏等采用人内皮细胞裂解物免疫小鼠，然而，魏先生的NM原文中的叙述 为：“The cells cultured in vitro, including a variety of endothelial cells or control cells, were collected and were washed three times with PBS. The cells were then fixed with 3% paraformaldehyde in PBS, pH 7.4, for 24 h at 4 °C, then washed three times and incubated at 37 °C for 2h to remove the residual paraformaldehyde. After being washed three times, the cells were resuspended in PBS for use as vaccines.”（引自魏等NM原文），魏等采用的是经 3%多聚甲醛固定24小时后再洗涤干净的人内皮细胞（我翻译的魏原文相应部分）。所 以，司先生所指的采用细胞裂解液，或者活细胞（异种活细胞进入体内后将在宿主免疫 系统的攻击下或自身死亡而最终裂解并释放蛋白），而魏的NM文章采用的却是各种特性 尤其是免疫特性相差甚远的固定的完整人内皮细胞。这样看来，司先生的第一个问题提 得有些不太适合，提问对象与被问的文章的研究对象不是一码事，有点象对卖卤鸡蛋的 说你家的蛋花汤做得如何如何，虽然都是鸡蛋做的，但特性却有很大的不同。 我们知道，经3%多聚甲醛固定24小时后，细胞基本保持原有形态，蛋白发生广泛的化学 交联，部分抗原表位丧失，但仍有许多抗原表位得以保留。但当我们深入探讨一下在此 固定的过程中发生的化学变化时，该过程实际上是多聚甲醛首先变成甲醛溶于PBS，然 后，在3%的浓度下，甲醛多是与细胞的蛋白中的赖氨酸的自由氨基发生缩合反应生成中 间体，然后再与酪氨酸的羟基反应主要形成分子间交联（但甲醛>4%时分子内交联的趋 势将上升），整个细胞所含的各种蛋白基本在原位被广泛地交联在一起，形成一个由原 位交联形成的交联蛋白大颗粒（显微镜下观察颗粒大小稍小于原细胞大小），在该颗粒 中，虽然不排除某些蛋白质的构象被破坏，但仍然有大量蛋白保留了其天然或近似天然 构象。这种交联蛋白大颗粒（象不象一个细胞蛋白骨架？细胞的脂类成分和一部分胞内 可溶性蛋白已经丧失）进入宿主体内后，在引起宿主免疫反应的过程和最终结果已经与 完整的活细胞或细胞裂解产物有着非常显著的差别。理由有三：第一，固定细胞进入体 内后的存在状态和分解过程完全不同，固定细胞在体内可以较长时间地保持其形态，由 于难以被吞噬，自身又不会被溶解，其解离分解可能会主要依靠体液中的少量蛋白酶、 水解、机械剪切等作用，因此其游离蛋白或多肽的释放是少量而缓慢的。而活细胞或细 胞裂解物进入体内可直接释放游离蛋白抗原，或是在死亡、被攻击裂解后大量地较快地 释放蛋白抗原。第二，固定细胞的蛋白抗原很难被呈递给T细胞免疫反应的相关细胞， 但可能更容易被B细胞识别并激活B细胞；而活细胞或细胞裂解产物则很容易同时引起细 胞免疫反应和体液免疫反应（这是免疫学的常识，不再复述）。固定细胞进入体内后作 为蛋白交联的大颗粒抗原，因为很难被吞噬或摄取蛋白抗原，即便被摄取，由于赖氨酸 和酪氨酸许多已经生成了不同于蛋白酶可降解的肽键C-N的与甲醛的C=N的化学键，也会 极大地干扰蛋白降解为可被提呈的多肽，因而很难实现T细胞效应途径的有效抗原呈 递，难以激活有效的T细胞免疫反应；然而固定细胞表面的仍然存在的抗原表位却可以 被B细胞接触、识别，从而提供B细胞的第一活化信号，然后，固定细胞再通过类似半抗 原载体的机制（或是其它机制？）活化某些CD4+T细胞，并与B细胞相互作用提供第二活 化信号，从而活化B细胞，并由CD4+T细胞辅助抗体的产生，最终引起体液免疫反应（第 二个理由是我的推论，欢迎广大网友指正，尤其是关于CD4+T细胞如何被活化的机 制）。第三，即便是在引起体液免疫方面，固定细胞和活细胞或细胞裂解物也有着非常 显著的不同。由于固定细胞在体内保持了其基本的完整形态，因此，大量内部的蛋白抗 原表位被遮盖，不能自由地刺激B细胞产生相应抗体，尤其是关于许多种属差异大的表 位，它们在进化上易位于蛋白质构象的内部，在蛋白抗原被吞噬、摄取、加工后才更容 易引起相应的抗体，而固定细胞因其从细胞形态和蛋白分子构象方面仍具有一定的完整 性，因此种属差异大的表位引起的抗体反应将大大不同于活细胞或细胞裂解物。 所以，我认为，采用固定细胞免疫和采用活细胞或细胞裂解物免疫，引起的宿主体液免 疫反应将有着非常显著的不同。为了部分回证我的观点，大略地查阅了一些相关的文 献。结果除了魏的文献，还真没在2003年以前的找到类似研究的文献，没有研究涉及固 定细胞引起免疫反应的机制的研究，我猜这也是魏等在文中也不正面回答司先生是因为 研究对象的不同造成的，而是引用了文献证明全细胞或其裂解抽提物产生的抗体可以不 是针对大部分细胞蛋白，存在仅仅是针对多种细胞蛋白的报道。2004年Corsini等 （Cancer Immunol Immunother (2004) 53: 955–962）报道，采用多聚甲醛固定（文 中未提及具体的固定条件）的牛大动脉内皮细胞免疫大鼠，产生的抗体可以识别鼠肿瘤 内皮、增殖的牛大动脉内皮细胞、增殖的人脐静脉内皮细胞、人肿瘤细胞、鼠肿瘤细胞 （呵呵，我估计这位仁兄是采用了更接近其它型别的大动脉内皮的缘故，把抗某些增殖 相关抗原的抗体也给打出来了），但在人脐静脉内皮细胞抽提物的WB中仅染色了1条主 带，1条弱染色带（我怎么看怎么觉得他的Marker不太对头，会不会标错了，因为我查 目录，他用的Marker应该还有一条185的带才对啊），部分提示了固定细胞免疫产生的 抗体特征可能不同于活细胞或细胞裂解物，其引起的抗体针对的抗原种类（尤其是那些 高丰度抗体所针对的抗原）较少。另外，Okaji等（Cancer Sci 2004; 95: 85–90）报 道采用0.025%戊二醛固定的鼠肝窦内皮细胞和人脐静脉内皮细胞免疫小鼠，产生的抗体 识别鼠内皮、人内皮，但不识别鼠肿瘤细胞，提示产生的抗体并不是针对大量的细胞蛋 白抗原的，否则应该与鼠肿瘤严重交叉，该文没有提供WB的结果，但在讨论中提到，采 用抗血清进行免疫沉淀获得了一个140KDa的蛋白，间接提示其WB结果不大可能是能染色 多数蛋白条带的，否则IP难以获得这个140KDa蛋白。同时我注意到，该文在观察到有效 的体液免疫反应的同时也观察到一些细胞免疫反应，这可能与其采用的固定液浓度过 低，固定时间短，分子交联不够广泛有关。 (XYS20060424) ◇◇新语丝(www.xys.org)(xys.dxiong.com)(xys.3322.org)(xys.xlogit.com)◇◇