(自然科学版)，2006，37(1)：145～148
文·献·综·述
远缘杂交理论在果树育种实践中的研究进展
杨红花1，卢继承1，李 伟1，秦宏伟2
(1.泰山学院生物科学与技术系，山东泰安 271021；2.山东农业大学食品科学与工程学院，山东泰安 271018)
收稿日期：2005-06-26
基金项目：泰山学院科研计划项目（Y04-2-03），泰安市2005年科技发展计划项目（2005-14-23）资助.
作者简介：杨红花(1976-)，女，博士，从事植物遗传育种研究.
AREVIEW OF ADVANCE IN DESTANT HYBRIDIZATION OF FRUIT CROP’S BREEDING
YANG Hong-hua，LU JI-Cheng，LI Wei，QIN Hong-wei
(1.Department of biological science and technology, taishan College Taian 271021,Shandong;2.Food and Science Department, Shandong Agricultural University, Taian 271018, Shandong, China)
Key Words:distant hybridzation; fruit crop; breeding
摘要：本文就远缘杂交理论在果树育种实践中的研究进展了概括性的论述，并对远缘杂交过程中存在的杂交不亲和性及杂种不育性等障碍的研究进展进行综述，同时对远缘杂交技术在果树育种实践的发展前景作了展望。
关键词：远缘杂交；果树；育种
中图分类号：S603.6 文献标识码：A 文章编号：1000-2324(2006)01-0145-04
我国是许多果树的起源中心(多样化中心或基因中心)，多年来，育种学家以丰富的种质资源为材料，采用有性杂交、实生选种等手段，创造出了一大批新种质、新品种，并在果树生产上发挥了重要作用。然而随着育种工作的深入，植物种内的遗传资源利用日益枯竭，同时也使得某些优良性状的基因库贫乏，采用种内资源进行常规育种难以取得很大突破，采用远缘杂交(Distant hybridization)技术综合利用现有栽培种的优良性状和野生种的抗逆性等特性，拓宽植物遗传资源范围，已成为种质创新的一条有效途径，日益受到育种者的重视。
目前远缘杂交在一些果树种、属间杂交获得成功，但由于远缘杂交的不亲和性及杂种的不育性等障碍，使得果树远缘杂交仍存在较大的难度，不成功的报道及未知数仍然很多。研究果树远缘杂交不亲和的机制，探讨克服杂交不亲和性及杂种不育性的有效措施，分析物种进化途径，有助于人们更有效地利用远缘杂交技术获得更多的远缘杂种，从而进一步丰富果树种质资源，扩展生物的遗传多样性。本文就远缘杂交理论在果树育种实践中的研究进展综述如下。
1 远缘杂交育种的理论依据
地球生命的共同起源及进化，决定了地球生物遗传上的同源性和异质性，这是实现远缘杂交及获得远缘杂种优势的物质基础。在同源异质遗传基础上借助于人为因素发生在不同植物种、属、科间的杂交，有别于经典的有性杂交，更多的是分子水平上的片断杂交，而往往没有双亲染色体的配对过程。早在1979年，周光宇［1］等就提出了常规远缘杂交存在着DNA片断杂交的假设。他们假设，从整体分子而言，亲缘关系越远的生物间的染色体和染色体外DNA的结构越不易亲和，很容易互相排斥；但从局部DNA分子来看，部分基因间的结构却可能保持一定的亲和性。因此当远缘DNA片断在母本DNA复制过程中有可能被重组而使子代出现变异。这种参与杂交的DNA片断可能带有部分亲和的远缘物种的结构基因、调控基因，甚至是断裂的无意义的DNA片断。因此他认为成功的远缘杂交大多数只能是DNA片断杂交，即部分与母本同源的DNA片断有可能重组进入母本，使杂种性状出现变异，由此提出DNA片断杂交假说。该假说与Pandeyt ［2］等人(1975)提出的卵细胞转化学说为远缘杂交育种提供了理论依据。上述理论也相应的被许多科学家的试验所证实，如刘春林［3］等人对水稻与高梁杂交后代的细胞和分子检测结果认为杂交是以染色体的小节段或DNA片段的形式参与受精过程，并可能在多个部位整合到参试母本的基因组中，由此引起一系列的变异。从这一角度来看，水稻与高粱的远缘杂交不是一个细胞水平上的杂交过程，而是一个DNA分子水平上的杂交过程，或者说是一个自然发生的遗传重组过程。邱纪文［4］等人(1999)对小麦与鸭茅状摩擦禾远缘杂交后代的RAPD及RFLP分析在分子水平上也证明了鸭茅状摩擦禾DNA可通过有性杂交方式整合到小麦基因组中，并且在加倍杂交后代第二代株系中仍能检测到来自父本的DNA片段，说明通过这种杂交方式整合到小麦基因组的异源DNA表现出相当的稳定性。
2 远缘杂交理论在果树育种实践中的研究进展
2．1 果树远缘杂交不亲和性的表现及机制
自交不亲和的分子机制是目前国际上植物发育分子生物学研究的热点问题之一。果树作物在该领域的研究亦取得了长足进展，迄今为止，苹果、梨、杏、甜樱桃等果树在S-糖蛋白的分离鉴定、S基因型鉴定以及S基因克隆等方面的研究均取得了很大进展。研究表明蔷薇科植物的自交不亲和性，是由具有复等位基因的单一位点即S位点(S-locus)控制，S-RNase基因（S基因)在花柱中表达，其产物是糖蛋白，具有RNase活性，降解花粉管中相同S基因的 RNA，因此S-RNase介导了雌蕊和花粉的不亲和性反应［5,6］。根据目前SI的研究进展［7,8］，S-Locus上参与SI反应的基因至少有两种，一种在花柱表达，即S-RNase(S）基因；另一种在花粉表达，即编码F-box蛋白的F-box基因(S-locus F-box protein gene，简称SLF或SFB)，花粉F-box蛋白参与了花柱S-RNase介导的配子体自交不亲和性(Gametophytic self-incompatibility，简称GSI)系统。
对果树自交不亲和性(SI）的研究则在很大程度上推动了果树杂交不亲和性机制的进展，然而对于杂交不亲和性分子机制的研究则非常有限。纵观国内外针对果树杂交不亲和性进行的相关研究发现，果树的远缘杂交，理论上是可能进行的，但又不像种内杂交那样容易做到。诸多的研究结果表明远缘杂交不亲和性主要表现为：花粉不能在异种柱头上萌发；花粉粒虽能萌发，但花粉管生长缓慢或花粉管太短，甚至破裂，不能进入子房到达胚囊；花粉管虽然能进入子房，到达胚囊，但不能受精；或只有卵核或极核发生单受精［9］。自从胼胝质荧光染色法问世以来，人们可以研究自交和种间及更远关系的远缘杂交中胼胝质在花粉和雌蕊组织中的特异性，从而使得研究自交不亲和及远缘杂交不亲和现象的表达部分鉴定成为可能。研究发现远缘杂交授粉后柱头乳头细胞内会积累大量的胼胝质，是柱头对异源花粉的一种特异性拒绝反应，而且胼胝质反应的强度和杂交亲本亲缘关系有一定的相关性。同时研究也认为果树远缘杂交过程中存在的杂交不亲和现象，其发生涉及到许多复杂的受遗传控制的相互作用，亦是物种间遗传差异的反映。物种亲缘关系越远，杂交成功的可能性越小，涉及到的影响因素也越多。这些因素包括如细胞间的相互识别、细胞内和细胞间的信号传导以及其他许多相关的影响因子，其中任何一个过程受到阻碍都可能导致不亲和性的发生［11］。
尽管对核果类果树种、属间杂交不亲和性机制国内外研究甚少，但也取得了一些阶段性的进展。这些研究多集中在远缘杂交后花粉与雌蕊互作方面，涉及到分子机制方面的尚未见报道。在蔷薇科植物的自交不亲和性研究中，发现自交不亲和的品种自交授粉后表现出花粉管顶端膨大，在花柱的某一位置停止生长，而亲和品种的花粉管可以到达胚囊，完成受精［5,6］。国内雎薇(1999)等对草原樱桃与欧洲甜樱桃远缘杂交不亲和原因的研究中发现，杂交授粉后花粉在柱头上虽少量萌发，但花粉管在柱头上横向生长，或盘绕、扭曲不能进入花柱，个别进入花柱的花粉管先端因沉积胼胝质而中途停止伸长，未能进入子房到达胚珠，没有观察到花粉管进入胚囊，从而说明这种杂交授粉后花粉管的不正常行为是导致草原樱桃与欧洲甜樱桃远缘杂交不亲和的主要原因。杨红花等(2004)在李、杏属间杂交过程中花粉和柱头的互作研究发现，李、杏杂交属于属间杂交，杂交过程中均有一定程度的花粉和柱头不亲和“拒绝”反应，表现为授粉后花粉粒的萌发生长受柱头上识别蛋白的抑制，多表现为成团及缠绕生长，很难顺利进入花柱引导组织，在柱头表面发现花粉管萌发不久就出现花粉管细胞壁胼胝体的加厚，顶端发出染色很亮的荧光。同时这种花粉和柱头不亲和及“拒绝”反应，在柱头的表现要强于花柱内部，与核果类果树自交不亲和的表达部位相似，所不同的是属间杂交后花粉管在柱头表面就受到强烈的抑制，在花柱中被抑制的程度比自交不亲和更强烈，发生得更早些。马瑞娟等人(2005)对桃李种间远缘杂交亲和性研究的结果表明，授粉后李的花粉粒在桃的柱头上萌发基本正常，花粉管在进入花柱中部以前生长正常，之后生长缓慢发育受阻，大多数花粉管不能进入子房，致使无法受精，同时指出这可能是桃李杂交不亲和、结实率低的主要原因。Wang等(1996)研究认为，当适宜花粉管进入花柱后刺激花柱引导组织表皮细胞死亡，可为花粉管生长发育提高营养物质和空间，但在种间杂交中，花粉管和异种花柱引导组织间存在不协调性，有可能使得异种花粉管得不到营养物质。在有些远缘杂交中，这种不协调表现在花粉和花柱引导组织细胞的渗透压不平衡，或在亲本双方生殖器官结构不协调。众多的研究表明［5］，杂交不亲和与自交不亲和的花粉管的生长表现基本一致，因此控制自交不亲和性的基因对于控制种间杂交不亲和性可能同样起作用。而Lewis和Crowe等人研究也认为杂交不亲和性可能与自交不亲和性相似，同样亦受与S-基因特性相似的相关基因的调控。
远缘杂交不亲和性的原因是极其复杂的，其遗传机制目前尚不十分清楚，至今尚未有定论。早在1931年，Andersont等提出种间杂交不亲和与自交不亲和相似，它们都是由S基因控制，随后Lewis和Crowe等人也提出同样的想法，而Pashkamath提出种间杂交是由S基因与其他基因相互作用所控制。综合众多学者的研究，认为果树杂交不亲和性的机理，可能有以下几种学说：①复等位基因学说：不亲和的遗传由一系列的S1、S2、S3…… Sn复等位基因控制。这些复等位基因间相互没有显隐性关系。当雌雄双方具有相同的S等位基因时表现出不亲和；②识别蛋白学说杂交不亲和性是由于花粉粒具有一种识别物质一糖蛋白。果树的杂交不亲和性主要是配子体不亲和类型，识别物质存在于内壁上。当花粉萌发时，花粉在柱头上能发芽，其内壁伸出花粉管，进入雌蕊不同部位时形成识别反应；③特殊物质学说在不亲和的授粉中，花粉管的伸长所以在中途受到抑制，是花柱或子房内产生特殊物质所致。在花粉发芽试验中，加入雌蕊各部分提取液进行试验，证明了这种物质的存在。但这种抑制物质是什么，在亲和性中如何起作用，还未搞清楚；④免疫反应学说：不亲和组合在花粉粒和柱头之间或花粉管和花柱组织之间，引起抗原、抗体反应，阻止花粉粒萌发或花粉管伸长；⑤S基因和其他基因互作，共同控制；⑥或者是由S基因之外的独立基因或多个基因控制。远缘杂交不亲和性的机制如何，将是植物学家进一步深入探讨的方向，也将是一个新的研究热点。
2．2 果树远缘杂交的不育性的表现及机制
远缘杂交的胚从形成到发育过程中，始终都存在着一些不协调的因素抑制其无法正常发育完全。远缘杂种的不育，主要表现有：受精后的幼胚不发育，发育不正常或中途停止；杂种幼胚、胚乳和子房组织之间缺乏协调性，特别是胚乳发育不正常，胚乳在发育过程中解体，胚得不到发育所需的营养，影响胚的正常发育，致使杂种胚部分或完全坏死；虽能得到包含杂种胚的种子，但种子不能发育，或虽能发芽，但在苗期或成株前夭亡；杂种植株不能开花，或雌雄配子不育，因而造成杂种的结实性差，甚至完全不能结实。以上现象发生在受精之后，又称为受精后的障碍或杂种衰亡。
对于造成植物远缘杂交受精胚珠内胚和胚乳败育的内在原因目前尚不清楚，一般认为胚、胚乳和子房组织间缺乏协调性，一方面可能在于胚产生了某种物质抑制胚乳的生长的生长，或者胚乳发育不正常，导致胚败育，或者营养分配不合理，胚珠被垄断了营养物质，而胚和胚乳没有得到应有的营养，或者杂种胚缺少某些化学物质或它们的浓度改变引起幼胚的死亡。有研究认为，减数分裂期遗传障碍是属种间不育的主要原因之一。在核果类果树远缘杂交中，4x与2x及6x的杂交会导致产生育性差的3x、5x类型，更有一些远缘杂种其生殖器官发育不全，不能形成雌雄配子。因此，对一些染色体数目虽然相等的种属间的杂种来说，由于减数分裂不正常以及基因不和谐，仍然可能是高度不育的。研究认为，杏和中国李杂种中，它们的染色体数都是2n=16，但并非都具有结实能力。若杂种的染色体在结构上发生变异，或一些具有多倍体关系的远缘杂种，由于减数分裂有较大的不规则现象，染色体的不规则分离，将使不平衡的孢子或配子大大增加，从而呈现高度不育性。雷家军(2002)等在草莓种间杂交试验中发现2×绿色草莓与2x东北草莓正反交均较易获得杂交种子，但正交结实率高于其反交，并且同倍性草莓种间杂交结实率较高，不同倍性草莓种间杂交以低倍体为母本时结实很差或完全不能结实，以高倍体为母本时杂交结实率较高。上述的研究结果丰富了果树远缘杂交育种理论，并逐步推进了果树杂种不育性的理论及育种实践的进展。
2．3 果树远缘杂交不育性的克服
2．3．1 离体胚培养(Embry oculture)或抢救(Embry orescue) 胚培养是植物组织培养的一个主要方面，早在20世纪初就作为一种育种手段， Laibach利用胚培养技术从杂种胚获得了杂种植株，克服了亚麻种间杂交不亲和性，尤其在挽救种间杂交败育胚方面的应用，开创了胚培技术应用于远缘杂交育种中的先例，并在其他植物育种上得到了广泛性的应用。果树的胚培养研究始于20世纪30年代。1933～1934年Tukey率先开展了李属的胚培养，是核果类果树胚培养的一个里程碑。20世纪 40年代起，胚培养技术开始广泛应用于果树育种，迄今已在柑桔、苹果、梨、猕猴桃及核果类果树中的杏、梅、桃、樱桃、李等多种果树树种上获得了成功。在果树远缘杂交育种中，通过胚抢救技术获得了多种果树杂交新种质，其中有些新种质已经在生产和育种中得到了应用，产生了较大的经济和生态效益。
对于远缘杂种胚，由于胚与胚乳的发育不协调，往往导致杂种胚的败育，因此，在杂种胚败育之前尽早进行杂种胚的挽救是获得远缘杂种新种质的重要途径。刘焕芳等人(2004)对中国樱桃和甜樱桃种间杂交获得的杂种胚进行了胚抢救，分别研究并建立了幼胚萌发与生长、丛芽诱导与分化及生根的最佳培养基配方，并成功地将一批杂种胚培苗定植于大田，为进一步的育种提供了种质材料。同时杨红花等人(2004)也获得了李杏属间杂种，利用胚抢救技术也获得了杂种胚培苗。研究发现，影响杂种离体胚培养或抢救的因素很多，国内外众多试验研究表明，胚龄(胚的发育指数或胚大小)对胚培养的成功率影响较大，是胚培养成功的关键因素之一，与胚培养成苗率存在正相关。胚的萌发能力与胚大小相关，一般来说成熟胚在比较简单的培养基上(只要含有大量元素的无机盐及糖)，能正常萌发生长；而未成熟的幼胚，特别是发育早期的幼胚，在离体培养时不易成功，胚越小，胚培养越困难，随着果实发育时间的延长，PF值依次增加，胚培养的成苗率依次增高。而更早期的杂种胚抢救技术值得进一步研究，因为其培养难度更大，但对于克服远缘杂种胚的早期败育，获得更多的远缘杂种胚培苗可能更为有效。
2．3．2 染色体加倍 染色体加倍可以克服染色体组不平衡引起的杂种不育。对于亲缘关系较远的二倍体杂种，在种子发芽的初期或苗期，用0．1％～0．3％秋水仙碱液处理适宜时间，能使体细胞染色体数加倍，获得异源四倍体(即双二倍体)。双二倍体在减数分裂过程中，每个染色体都有相应的同源染色体可以正常进行配对联会，产生具有二重染色体组的有生活力的配子，从而大大提高结实率，在酸樱桃和甜樱等多种植物的种间杂交中都有成功的报道［26］。但是染色体加倍的机制仍然不完善，杂种育性低的现象仍会存在，采用通过回交法，延长培育世代、加强选择，改善营养条件，人工辅助授粉，也能克服远缘杂种的不育性，提高远缘杂种的结实率。
2．3．3 高温处理 杂种衰败在远缘杂种成熟过程中，是一个严重的制约因素，在许多作物的远缘杂交过程中都有报道。有研究表明，高温可以有效地阻止水稻、番茄以及棉花等许多作物的杂种衰败现象，但机理不明确。在果树上，许多科学家对获得的梨和苹果的属间杂交种衰败现象也进行了探讨，但对于其杂种衰败现象的遗传基础研究甚少。Eiichi等(2003)研究了高温对于梨及苹果属间杂种的离体胚再生苗生长的影响，发现在20℃～25℃范围内组培苗完全褐化，虽有微小生长但5周后死亡；30℃处理下有少量生长但叶片表现褐化；34℃组培苗的生长旺盛却没有出现褐化；38℃以上组培苗生长也较健壮，但表现异常的表现型，如叶片狭小及茎段加厚等。Eiichi等 (2003)研究结果认为高温(34／30℃)对杂种F1代的衰败现象有明显的抑制作用，高温抑制梨与苹果属间杂种衰败与其他作物之间有很大的相似性，这些结果对于克服远缘杂种衰败提供了可能性的依据。同时高温在打破自交不亲和性方面可能也有效，在樱桃等其他植物均有探讨性的报道，但无法全面解释打破自交不亲和的机理，尚需进一步的研究和探讨。
2.4 果树远缘杂交杂种后代遗传变异复杂
远缘杂交后代比种内杂交的后代具有更为复杂的分离，一般来说，其分离世代更早，往往在F1就出现分离。研究表明，远缘杂种性状分离的复杂性，与其染色体组型的变化关系十分密切，尤其是在属间的远缘杂种中，有时是双亲整个染色体组的合并，有时则是个别染色体的代换或添补，个别染色体节段的易位也常常出现等。有研究报道认为，远缘杂交能够造成杂种基因组DNA的含量和结构改变，同时由于远缘杂种存在单倍体染色体组，其在减数分裂时染色体联会、配对、分配不规则，导致同源、非同源重组以及大量非整倍体的形成，因此导致杂种后代广泛分离，出现超亲遗传，产生一些双亲没有的新性状。这些原因，造成了远缘杂种后代比种内杂交的后代具有更为复杂的分离现象。
远缘杂种后代的分离，研究实践总结为如下几个类型：①综合性状类型杂种具有二个杂交亲本综合的性状，但是，综合性状类型的杂种一般很不稳定，随着不断的繁殖，将继续发生分离，有的可能向双亲性状分化，也有的可能形成新种类型；②亲本性状类型 杂种的性状倾向于这个或那个原始种或亲本，甚至与原始亲本完全一致。这可能是由于远缘花粉在受精过程中产生的刺激作用，形成无融合生殖类型。或者某一亲本(一般是父本)的遗传物质与另一亲本(一般是母本)的代谢过程不相适应，以致完全被排斥等等；③新物种类型 远缘杂交种出现了“突变”性质的变异，成为另一个新种植物。
远缘杂种的分离现象极为复杂，目前对分离的规律还未完全了解。刘孟军(1998)以富士苹果和山定子及二者的种间杂交F1代为试材，对RAPD标记在苹果属种间杂交一代的分离方式进行了研究，结果表明，RAPD标记在F1代的分离方式可归为3类，即呈孟德尔分离，偏离孟德尔分离比例和异常分离，而异常分离的现象，能提供新的RAPD多态性，在研究育种行为以及亲缘关系等方面具有重要应用价值。SulanLuo
(2002)等人在葡萄种间杂交一代RAPD标记分离规律中也观测到相似的结果，并且也发现杂种后代扩增条带缺失或增多的现象。远缘杂交的遗传规律尚未定论，深入研究远缘杂交的遗传机制，将对控制远缘杂种的分离，以及对远缘杂种的选择、培育等具有重要的实践意义。
3 小结与展望
综上所述，果树的远缘杂交育种工作以及分子标记在种质资源亲缘关系及遗传多样性等方面均取得了一定的成就和进展。然而我们也应该看到果树的远缘杂交虽已在一些种、属间获得了成功，在种质选育及创造新类型等方面取得了很大成绩，但由于远缘杂交本身存在的杂交不亲和性及杂种不育性等障碍，果树的远缘杂交仍存在较大的难度，未知数仍然很多，有关果树远缘杂交不亲和的机制国内外报道很少，进展较慢。因此进一步研究并探讨远缘杂交不亲和性的可能机理并采取有效的克服杂交不亲和性的方法，同时对杂种后代的不育性的克服，并借助现在分子标记技术对杂种后代进行早期鉴定以及复杂遗传规律的探讨，将有助于推进果树远缘杂交事业理论及实践的发展，从而进一步丰富果树种质资源，扩展生物的遗传多样性，意义非常深远。
参考文献
〔1〕周广宇．远缘杂交分子基础-DNA片断杂交假说的一个例证〔J〕．遗传学报，1979，(4)：405-412
〔2〕苏学和，高国强，时香玉等．利用花粉辐照技术进行棉花种间远缘杂交研究〔J〕．山东农业科学，2000，2：8-10
〔3〕刘春林．利用RAPD技术对远缘杂交后代的分子遗传学研究〔J〕．湖南农业科学，1998，1：22-23
〔4〕邱记文，金德敏，李传友等．通过远缘杂交将鸭茅状摩擦禾DNA片断导入普通小麦基因组的分子证据〔J〕．科学通报，1999，2162-2165
〔5〕Wang Y，Wang X，Skirpan A L，Kao T H，S-RNase-mediatedself-incompatibility〔J〕．JExpBot，2003 54(380)：115-122.
〔6〕Nathanae I R，Hauck，Hisayo Yamane，RyutaroTao，Amy F．Lezzoni．Self-compatibility and incompatibility in tetraploid sour cherry (PrunuscerasusL．)〔J〕．Sex Plant Reprod，2002，15：39～46
〔7〕Ushijima K，Sassa H，Dandekar A M，Gradziel T M，Stmctual and transcriptional analysis of the self-incompatibility locus of almond：Identification of apollen-expressed F-box gene with haplotype-specific polymorphism〔J〕．Plant Cell，2003，15(3)：771-778.
〔8〕Qiao H，Wang H，Zhao L，Huang J，Zhang Y，Xue Y，The F-box protein AhSLF-S2 physically interacts with S-RNases that may be inhibited by the Ubiquitin／26S proteasome pathway of protein degradation during compatible pollination in Amirrhinum〔J〕．Plant Cell，2004，16：582-595
〔9〕杨杰，于小艳，李玉花．植物亲和受精过程中花粉管的粘附和定向生长〔J〕．植物生理学通讯，2004，40(6)：659-665