送交者: fishman 于 2006-4-06, 08:07:21:
◇专家述评◇肿瘤免疫研究的回顾与展望
司履生(西安交通大学生命科学与技术学院癌症研究所，陕西西安710061)
第26卷第2期2005年4月西安交通大学学报(医学版)JournalofXi’anJiaotongUniversity(MedicalSciences)Vo1．26NO．2Apr．2005
摘要：2O多年来，本校免疫病理研究室一直从事肿瘤免疫的研究，从研究肿瘤浸润淋巴细胞的活化和肿瘤逃逸的机制开始，到探索诱导浸润淋巴细胞(tum0卜infiltratinglymphocytes，TIL)活化的最佳条件，并将这些研究结果转化为肿瘤免疫治疗和免疫预防的实践，从一个侧面反映了人类在征服肿瘤道路上的艰苦历程。
关键词：肿瘤免疫；肿瘤逃逸；免疫治疗；免疫预防
中图分类号：R730．3文献标识码：A文章编号：1671—8259(2005)02—0097—04
Review and prospectoftumorimmunity research SiLiisheng (InstituteforCancerResearch，SchoolofLifeScience& Technology， Xi’anJiaotongUniversity，Xi’an710061，China)
ABSTRACT ：Forovertwentyyears，thelnsituteoflmmunopathologyofXi’anMedicalUniversity，theantecedent Institute of Cancer Research， has long been engaged in the study on tumor immunity． Beginning with the explorationofthe mechanisimsfortheactivationoftumor•infiltrating lymphocytes(TIL)and tumorevasion till translating thereleva0tachievementsinto tumorimmunotherapy and immunoprevention． From one facet，allthe factsreflectthearduouscourseofthestruggleofhumanbeingsforconqueringcancer． KEY W ORDS：tumorimmunity；tumorevasion；immunotherapy；immunoprevention
尽管在过去100年里，尤其是近2o年中，世界科技进步的速度已明显加快，人们登上太空已不再是梦想，取肝换肾也已经十分平常，但恶性肿瘤依然是人类的头号杀手，而且每3个人中就有1个人在其一生中的某个时刻一定会受癌症的困扰。正是在这种形势下，我们开始了攻克癌症的征程。2O世纪中，肿瘤研究的最伟大的成就集中表现在以下三个方面：①病因学的研究，证实人类绝大多数肿瘤是由环境因素引起的；②人类绝大多数肿瘤是通过一个多阶段的缓慢演进过程发生的；③肿瘤发生是宿主本身所具有的强大抗瘤机制失败的结果，而免疫是机体最重要的抗癌机制。2O世纪7O年代末，知识分子刚刚有机会静下心来开始念书的时候，走进图书馆，我吃惊地发现，过去1O年中世界先进国家的科学技术飞速发展，成就斐然。免疫学的成就尤其吸引着我。貌似一致的淋巴细胞是一个功能上很不均一的群体，可被分为T淋巴细胞、B淋巴细胞、K／NK淋巴细胞，它们在肿瘤免疫中具有不同的作用。于是一个幼稚的想法浮现脑际，应当证实和分离出T淋巴细胞，因为它们是肿瘤免疫的主要效应细胞。从此，我们与肿瘤免疫结下了不解之缘。
虽然我们在这一领域中取得不少成绩，但在肿瘤免疫固有的复杂性面前，我们的成绩依然是微不足道。
1肿瘤浸润淋巴细胞不活化是肿瘤免疫失败的根本原因
肿瘤局部是宿主与肿瘤相互作用的主要战场，是宿主免疫系统防御肿瘤的前线，而局部淋巴结是宿主对抗肿瘤进一步扩散、放大肿瘤免疫的前沿兵站。2O世纪8o年代，我们对乳腺癌、胃癌、肠癌、宫颈癌局部的浸润淋巴细胞进行了相当深入的分析，并与妊娠免疫及慢性炎症病变中的浸润淋巴细胞(tumor—infilt—latinglymphocyte，TIL)进行对比研究，发现肿瘤组织中TIL的数量与肿瘤生物学行为有明显的关系。肿瘤中的淋巴细胞浸润是宿主对肿瘤的特异性免疫反应，TIL中以T细胞为主，TIL不活化，不与瘤细胞接触是其缺乏功能的主要原因_1]。利用免疫电镜观察我们首次证实CD8T细胞可侵袭瘤细胞，诱导 瘤细胞凋亡，是杀伤瘤细胞的主要效应细胞_2]。肿瘤诱导的局部淋巴结反应有T区增生、B区增生、窦组织细胞增生和反应衰竭四种形式，反应衰竭患者的预后最差，T区增生的患者预后最好口]。而且淋巴结的反应总是从最初的免疫刺激即以淋巴细胞增生为主的反应向反应衰竭方向发展，反应衰竭是免疫失败的象征]。我们对TIL不活化的机制一直在进行更深入的研究，包括其黏附分子与细胞因子的表达j。
2肿瘤浸润淋巴细胞不活化，并非由淋巴细胞本身固有缺陷引起
在体内，肿瘤局部浸润淋巴细胞不活化是一个事实，但如将TIL分离，进行体外培养，用适当的致裂原或瘤细胞刺激后，TIL仍可活化，并杀伤瘤细胞；同时，根据前述肿瘤局部淋巴结存在T区增生反应的事实，说明TIL不活化的机制，并非由于T淋巴细胞功能固有缺陷所致_1]，最可能的原因是肿瘤局部微环境中存在某种或某些抑制淋巴细胞使之不活化的因子所致。而且，我们认为，既然TIL可被招募至肿瘤局部，说明肿瘤免疫失败的原因的主要问题并非发生在抗原提呈之前，而是在抗原提呈之后或抗原提呈过程中，主要由免疫下调，或肿瘤局部存在某种或某些细胞因子，或抑制免疫的细胞所致。这一设想已经为最近的一组实验所证实。将低免疫原性肿瘤细胞D5与同系小鼠脾细胞混合培养后，我们发现脾细胞中有明显的调节T细胞(Tr细胞，一种具免疫抑制功能的T细胞)增生，而且培养上清中免疫抑制因子，如IL-10、TGF—B也明显增高。目前我们正对低免疫原性肿瘤诱导Tr细胞增生的机制及其在肿瘤免疫反应中的动力学进行分析。另外，我们对瘤细胞进行蛋白质组学分析时，还发现肿瘤细胞可表达IgG重链高变区分子，即抗体的Fab片段。和CTLA4分子，CTLA4分子已知具有免疫抑制功能，但肿瘤细胞所产生的抗体片段的性质和功能也值得进一步探索。
3从实验研究向临床研究转化的探索
既然TIL的失活并非源于淋巴细胞本身的固有缺陷，经不同的生物反应调节剂或细胞因子的作用可以使之重新活化，我们开始了寻找使TIL活化的最佳生物因子和最佳条件。我们先后克隆了多种因子的cDNA，并建立了用原核或真核表达系统对之表达及分离纯化的技术15,78,16-17]，对晚期肿瘤患者建立了分离TIL的方法，使之体外活化，重新回输活化自体TIL的过继治疗m，开发了新的不良反应较小的免疫佐剂，使用自体瘤苗进行主动免疫治疗，对一部分患者确实获得了较好的效果。为了进一步提高自体瘤苗的治疗效果，最近我们注意到淋巴细胞减少小鼠所增生的T淋巴细胞，即淋巴细胞减少驱动的淋巴细胞增生(1ymphopenia—drivenprolifera—tion，LDP)，具有更高的杀伤肿瘤细胞活性的事实，并进行了动物实验。在化疗和放疗前用亚致死量处理小鼠建立了淋巴细胞减少、骨髓重建的模型，即免疫重建淋巴细胞减少小鼠(reconstitutedlyre—phopenicmice，RLM)模型，对其用肿瘤疫苗免疫后，再接种同一肿瘤，在观察其免疫保护的同时；对其进行效应机制的分析。结果证实，LDP所产生的T淋巴细胞，其活化阈值明显下调，有助于打破淋巴细胞对肿瘤抗原的免疫耐受，并选择性扩增高亲和度的肿瘤性T细胞；同时发现DC细胞的频数在肿瘤引流淋巴结中也明显增高，DC细胞增多对LDP时的淋巴细胞活化也有重要促进作用L2引。这些发现将改变肿瘤免疫治疗的传统理念，即认为化疗放疗会引起患者淋巴细胞减低，免疫能力下降，化疗放疗后免疫治疗不能立即进行，必须等待至淋巴细胞数恢复正常后方可开始的观点。根据前一阶段动物实验结果，我们针对人类肿瘤的特点，设计了利用化疗药物造成淋巴细胞减少、自体淋巴细胞回输、自体瘤苗接种及淋巴因子持续注射的晚期肿瘤患者综合主动免疫治疗方案，已经开始了一期临床试验，从现有的几例在体和体外的多种免疫指标检测结果及患者的临床改善情况来看，这一治疗方案是比较成功的，已经受到国外有关专家的注意，并与我们在这一领域建立了合作关系。
另外，我们开展了对子宫颈癌预防的研究，子宫颈癌是已知的少数几个由病毒引起的恶性肿瘤。自2o世纪8o年代以来，越来越多的证据表明高危型人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)是子宫颈癌的启动因子。在我国尤其是陕西地区是子宫颈癌的高发地区，我们的流行病学资料也证明人乳头瘤病毒感染也和我省子宫颈癌高发有关。基于对感染与免疫的认识，以及动物(牛、兔、犬)乳头瘤病毒感染可以通过使用相应乳头瘤病毒疫苗接种进行预防的事实，我们设想，通过HPV疫苗接种，预防HPV感染以达到从根本上预防子宫颈癌及HPV相关性肿瘤的目的，于是我们也开始了HPV预防性疫苗的研究工作。
然而，HPV的生物学特性，使得根本不可能使用天然病毒颗粒以制备减毒活疫苗，因为HPV有严格的种属特异性，只感染人类，不感染动物，而且在人类病变中病毒颗粒含量很低；同时，HPV的病毒颗粒成熟和复层鳞状上皮的分化成熟严格同步，因而无法在体外培养感谢分子生物学技术的飞速发展和分子病毒学的巨大成就，使我们能够在实验室表达HPV的各个亚单位蛋白，制备和改造HPV的基因及其片段，以及制备HPV病毒样颗粒、免疫动物，进行疫苗的可行性和有效性试验。
通过1O多年的努力，我们先后尝试了至今所有的不同类型的疫苗，比如亚单位疫苗、DNA疫苗[24-25]、VLP疫苗[z6-z9]、植物可食用性疫苗以及重组载体病毒活疫苗。除亚单位疫苗外，其他几种类型疫苗接种后都能有效地激发动物的免疫反应，都可诱导动物产生特异性抗体和特异性细胞毒性T细胞。和国外同时代的HPV预防性疫苗研究相比，我们的研究工作具有以下特点：
VLP疫苗：利用基因工程技术在体外表达的HPV的L1或L1／L2蛋白有自组成病毒样颗粒(vi—rug—likeparticle，VLP)的能力，它们保持有天然病毒颗粒的特性，可以激发免疫动物产生中和抗体，阻断病毒侵入细胞，这是目前最受注意的HPV预防性疫苗。美国的HPVVLP疫苗已经开始了人体试验，二期试验结果确证HPV16VLP可以预防女性生殖道的HPV感染。他们所使用的VLP疫苗是利用昆虫杆状病毒SF一9细胞表达系统表达的。使用这一表达系统制备VLP疫苗，需要超速离心，纯化蛋白，过程复杂，成本高，因而价格昂贵，不适合于在发展中国家普遍使用。我们对这一表达系统进行过两方面的改进，使其制备过程更为简捷容易，一是在表达的目的蛋白上加了6个his标签，这样就可以利用金属柱进行纯化，纯化后的蛋白同样可组装成VLP，具有与天然VLP相似的一切生物学活性；另外，我们使用了S2果蝇细胞表达系统，对其进行表达，结果表达量显著提高，这样就使得疫苗的制备成本大大降低。目前，我们已经完成了对引起女性生殖道增生性病变的最常见的HPV16，HPV18，HPV58，HPV6和HPV11的预防性VLP疫苗的临床前研究工作，只是等待进行临床试验。
黏膜免疫途径：女性生殖道HPV感染主要是通过性接触进行传播，女性下生殖道黏膜是其最主要的侵入门户，因而如何提高生殖道的黏膜免疫就成为一个不得不考虑的问题。黏膜免疫系统是和系统免疫系统不同的另一个免疫系统，利用注射途径接种疫苗只能激发全身的系统性免疫，较少唤起有效的黏膜免疫。只有通过黏膜免疫途径如经口、经鼻进行免疫接种才能诱发有效的黏膜免疫。经阴道、经直肠免疫当然可以诱发有效的尿生殖区黏膜免疫，但是对性成熟前的少女进行这样的免疫显然是违反伦理的，而对于少男更难进行。自然经口、经鼻行免疫接种应当是优先考虑的。不过，这种途径接种就必须考虑免疫耐受的问题，为此，我们利用基因工程技术表达了LTB，即大肠杆菌不耐热毒素B亚单位，这是迄今为止已知的最强有力的黏膜免疫佐剂，并且利用口服途径对小鼠进行VLP免疫，同时给予LTB，结果证明后者可以大大增强阴道黏膜免疫效果[3。
前述的VLP疫苗不论那一种制备方法都需要体外培养表达VLP的细胞，分离和纯化蛋白技术，而且所制备的VLP也存在储存，避免失活的技术，我们设想如使用重组载体活疫苗技术，将HPVL1蛋白重组入痢疾杆菌，利用其感染肠道上皮，将HPV的u基因导入人的肠上皮细胞，使之表达，诱发黏膜免疫，达到预防HPV感染的目的，也许会更好。我们之所以选择痢疾杆菌作为载体，是因为痢疾杆菌只侵袭肠道上皮，不进入血行，无引起全身播散的担心，而且痢疾杆菌的免疫原性较低，一般只引起短暂的瞬时免疫，不会引起终生免疫，不会因产生对痢疾杆菌的过强免疫而遮盖对目的抗原，即对HPV的免疫。经过数年来的努力，我们选择了突变的减毒志贺氏痢疾杆菌菌株，利用重组技术将HPV16L1基因插入志贺氏杆菌的基因组，检测其在体外表达HPVL1蛋白的能力及生物学特性，在证实其确有产生VLP并具有一定的侵袭性之后，我们进行了在体试验，用新构建的重组减毒痢疾杆菌一HPV16预防性活疫苗经结膜囊接种免疫豚鼠，观察其能否唤起豚鼠对HPV16L1蛋白的体液免疫和细胞免疫反应。我们的结果是成功的，并且已经构建了可用于预防HPV18、HPV58等其他类型HPV感染的疫苗。
转基因植物疫苗：可食用性预防性HPV转基因植物疫苗应当是最为经济、最为方便，可广泛使用的疫苗。这是因为植物是最好的生物反应器，仅仅光合作用就可将太阳能转化为生产的目的蛋白，而省去了实验室中培养细胞、纯化蛋白等操作所需的大量成本。为此，我们建立了HPV16I1基因转化的烟草植株，并且在田野里种植成功，生长出的烟草表达可自组装成VLP的HPV16L1蛋白，经饲喂动物证明，该烟草同样具有诱发动物产生特异性免疫的能力，说明用转基因植物表达目的蛋白做疫苗是可行的。目前我们正在建立表达HPV16L1蛋白的番茄、黄瓜等可食用的植物疫苗。
总之，数十年来经过共同努力，我们虽然备尝艰辛，确有一点成绩，但由于种种客观和主观原因，眼看美国的HPv16预防性疫苗已经进入临床试验，而我们自己独立研制的有知识产权的成果却得不到转化。在读了“中国现代化报告2005”以后，这一问题更不能不引起我们的深思。
参考文献：[13SiLiisheng，WangYili，ZhangYunJing．InfiltratingTlympho-cyteactivityingastricandcoloniccancerandearlydeciduasEJ]．chinMedJ，1987，lOO(12)：961—964．[23王一理，袁定东．T淋巴细胞亚群与癌细胞相互作用的原位免疫电镜观察EJ]．西安医科大学学报，1987，8(1)：32—35．[31西安医学院第一附属医院病理科．乳癌时腋淋巴结改变与预后的关系[J1．肿瘤防治研究，1978，4：67—72．[41司履生，王一理，杨居祥．胃癌局部淋巴结的免疫组织观察[J]．中华病理学杂志，1987，16(3)：219—222．[5]陈蕴颖，司履生，王一理，等．人肿瘤组织中的B7．1表达[J1．中华病理学杂志，1997，28(1)：46．[61SiLiisheng，SiHuaxin，ChenYunying，eta1．B7．1antigenex—pressionintumorcellsfromcanceroushumantissues[J1．Ana．1ytQuantitCytolHistol，1999，21：521．[7]ShenWenhong，WangYili，GengYiping，eta1．BacteriallyproducedhumanB7．1proteinencompassingitscostimulatoryactivityinvitro[J1．ChinMedJ，2000，113(8)：714．[8]陈梅珍，司履生，王一理，等．抗B7．1分子不同亚区单克隆抗体的制备[J1．中华病理学杂志，2001，30(4)：303—304．[9]LiRui，TtingerDR，LiRong，eta1．Analysisoftheimmuno-logicalmicroenvironmentatthetumorsiteinpatientswithnon-smallcelllungcancer[J1．Langenbeck’sArchivesofSurgery，2003，DOl：10．1007／s00423—003—0416—0(Ml，SC1)．L101WangYili，SiLiisheng，AnisaKanbour，eta1．WhitesideLym—phocytesinfiltratinghumanovariantumor：synergybetweentumornecrosisfactorandinterleukin2inthegenerationofCD8+effectorsfromtumorinfiltratinglymphocytes[J]．CancerRes，1989，49：5949．[11]司履生，王一理，方亮．多抗甲素对外周血单个核细胞细胞毒活性的影响[J]．中华病理学杂志，1991，20(2)：128—130．[12]王一理，司履生．IL．2和TNFa在诱导特异性细胞毒性T细胞中的协同作用[J1．中华微生物与免疫学杂志，1992，12(2)：87—89．[131ZhangYingtao，GengYiping，SiLiisheng，eta1．Proteomica．nalysisofametastaticversusnonmetastatichumancolorectalcarcinomacellline[J1．JTumorMarkeroncol，2004，19(4)：275——283．[14]王一理，耿宜平，司履生．白细胞介素6抗肿瘤作用的实验研究[J1．中国肿瘤生物治疗杂志，1995，2(2)：131．[151张梅，司履生，金莉，等．重组人单链白细胞介素12融合基因的构建，真核表达及生物学活性测定[J1．中华血液学杂志，2000，21(12)：636．[16]YanXiaocai，MaJun，ZhengJin，eta1．RecombinanthumanB7．2lgV—likedomainexpressedinbacteriamaintainsitsat)-stimulatoryactivityinvitroEJ1．ChinMedJ，2002，115(7)：1O53—1O57．(SC1)[171李瑶琛，孔令洪，王一理，等．人重组TNF-a突变体471的初步纯化及生物学活性[J1．细胞与分子免疫学杂志，2003，19(4)409—412(M1)．[181姚德茂，潘承恩，王一理，等．肿瘤浸润淋巴细胞、重组白细胞介素2治疗对手术后原发性肝癌病人细胞免疫功能的影响[J1．中华实验外科杂志，1995，12(5)：257—258．[19]姚德茂，潘承恩，王一理，等．肿瘤浸润淋巴细胞和重组人白细胞介素2对进展期肿瘤病人细胞免疫功能的影响[J1．中华实验外科杂志，1996，13(2)：82—83．[2O]张王刚，王一理，曹星梅，等．急性单核细胞白血病新型主动免疫治疗的初步观察[J1．中华血液学杂志，1997，18(1)：7．[211ZhangWanggang，WangYili，CaoXingmei，eta1．Thenovelactiveimmunotherapyofleukemia[J1．BriJHaematol，1998，102f85．[22]齐旭，周伊，王一理，等．同系细胞瘤苗对低免疫原性小鼠黑色素瘤治疗作用的研究[J1．中国肿瘤生物治疗杂志，2002，9(1)：60—61．[231MaJun，UrbaWJ，SiLiisheng，eta1．HuHManti—tumorTcellresponseandprotectiveimmunityinmicethatreceivedsublethalirradiationandimmunereconstitution[J]．EurJlmmunol，2003，33：2123—32(SC1)．[241SunXiangle，SiLusheng，CaoZansun，eta1．1mmunoresponsetoplasmidDNAencodingHPV16L1[J1．ChinJMed，2000，113：298—301．[251SongJianming，SunXiangle，LiuTianju，eta1．pcDNAL1ge—neticimmunizationcaninducespecificcell-MediatedimmunueresponsesinC57BL／6mice[J1．ChinMedJ，2002，115(11)：1697—1700(SC1)．[261郑滨，王健伟，姜惠英，等．利用昆虫一杆状病毒表达系统表达人乳头瘤病毒16型L1蛋白[J1．中华实验和临床病毒学杂志，2001，15(4)：314—316．[271郑瑾，张福萍，司履生，等．HPV16L1／E6．E7基因嵌和DNA疫苗质粒构建及其在CHO细胞表达的初步研究[J1．中华实验和临床病毒学杂志，2003，17(1)：66—69(MI)．[28]ZhengJin，SiLiisheng，SongJianming，eta1．Enhancedlm．muneresponsetoDNA-basedHPV16L1vaccinationbycostimu．1atorymoleculeB7—2[J1．AntivRes，2003，59：61—65(SCI)．[291ZhengJin，MaJun，YangXiaofeng，eta1．Highlyefficientandeconomicalbaculovirusexpressionsystemforpreparinghumanpapillomavirustype16virus—likeparticle[J1．ActaBiochimicaetBiophysicaSinica，200436(8)：548—552(SCI)．[301WangJing，LiLinlin，ZhengJin，eta1．Highlyefficientex—pression，purificationofrecombinantLTBproteinanditsactivi．tyagainstmucosalimmunoadjuvantbynasalimmunization[J1．ChinMedJ，2003，116(7)：1115一l117(SC1)．(编辑卓选鹏)
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