高发得(Godfather)的看法很有见地



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送交者: 桂铭 于 2006-1-23, 13:57:27:

我的确没有注意到PH-SA和链霉素的等电点问题。

理论计算colicin Ia的pI是9.16,融合蛋白是9.03,在pH的条件下仅带0.4个正电荷。这样的话,蛋白的确结合不牢固,容易被洗脱丢失。链霉素在pH9.0的条件下带正电荷,可以被带负电荷的交换柱吸附,并很可能随蛋白的洗脱而洗脱,残留在蛋白溶液里。

但是,丘的早期文章也是用相同的条件制备colicin Ia,虽然条件很不理想,但是他应该还是得到了产品。

另外,上交换柱之前如果做了充分透析,链霉素的残留仍然应该非常低。高发得认为,因为在pH9的条件下,目标蛋白和链霉素都带相同的正电荷,应该不会结合,也就是应该很容易在透析过程中被分开。张杰说:80-100ml破菌上清液加入数克硫酸链霉素后,在半小时至一小时搅拌中析出大量DNA-硫酸链霉素沉淀物,离心去除沉淀物后装入透析分子量15,000的透析袋
(硫酸链霉素分子量1,450左右),经两次各5000ml透析液透析16小时(XYS20060116)。丘小庆说,经第一次沉淀离心后,“300ml上清液中还残留600mg链霉素”。

300 ml经过两次各5000ml透析,链霉素将会被稀释1.2x10-5倍,以600mg的原浓度看,链霉素应该只剩0.0072mg。以赵利军说的那样,“丘小庆在200ML的细菌裂解液上清中加入12克链霉素(一般是3克)”,两次透析后,也应该只剩不到1mg。交换柱即使富集了残留的链霉素,仍然不应该达到4.6mg/ml的程度。

当然,我们不知道在具体操作过程中,会有什么别的失误。

说某种细菌对某种药物耐药,并不意味就不能被该种药物杀灭,这是相对于作用浓度而言的。

丘说:该制备中抗菌多肽含量为1mg/ml左右(XYS20060118)。PH-SA的工作浓度是1~5 ug/ml,就是说,要稀释1000~200倍。4.6mg/ml的链霉素被稀释1000~200倍,就是4.6~23 ug/ml。赵利军引用的文献里,链霉素的MIC50是32~64ug/ml。23 ug/ml的链霉素虽然可能抑制不到30%的MRSA生长,可是谈不上对MRSA有杀菌作用。

丘是用游离的AgrD1来拮抗过Ph-SA的作用,显示其是通过AgrD1的特异识别来发挥作用的(Fig4c)。

是实验设计不佳,还是人为操作失误,还是有意造假?真相如何,拭目以待。




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